凝膠制備方面

• 選擇合適的凝膠濃度：不同濃度的凝膠適用于分離不同分子量范圍的生物大分子。一般來(lái)說(shuō)，分離較小分子量的蛋白質(zhì)或核酸，需要使用較高濃度的凝膠；而分離較大分子量的物質(zhì)，則適合用較低濃度的凝膠。例如，分離分子量較小的寡核苷酸，可選用 12% - 20% 的聚丙烯酰胺凝膠；分離分子量較大的基因組 DNA，常使用 0.7% - 1.0% 的瓊脂糖凝膠。

• 優(yōu)化凝膠聚合條件：凝膠聚合的均勻性對(duì)條帶分辨率至關(guān)重要。要確保聚合試劑的純度和活性，按照正確的比例配制凝膠溶液。在聚合過(guò)程中，溫度和時(shí)間要控制得當(dāng)，通常在室溫下讓凝膠自然聚合，避免溫度過(guò)高或過(guò)低導(dǎo)致凝膠孔徑不均勻。同時(shí)，要注意避免凝膠中出現(xiàn)氣泡，因?yàn)闅馀輹?huì)破壞凝膠的連續(xù)性，影響分子的遷移。

樣品處理方面

• 充分變性和分離：對(duì)于蛋白質(zhì)樣品，在處理時(shí)要加入足夠的變性劑（如 SDS）和還原劑（如 β - 巰基乙醇），使蛋白質(zhì)充分變性并打開(kāi)二硫鍵，形成線(xiàn)性分子，以保證其在凝膠中按照分子量大小進(jìn)行分離。對(duì)于核酸樣品，可通過(guò)加熱或加入變性劑等方法使其變性，防止形成二級(jí)結(jié)構(gòu)或高級(jí)結(jié)構(gòu)，影響電泳遷移率。

• 控制樣品濃度和體積：樣品濃度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致條帶拖尾、分辨率降低，而過(guò)低則會(huì)使條帶信號(hào)微弱。因此，需要通過(guò)準(zhǔn)確的定量方法確定合適的樣品濃度，一般蛋白質(zhì)樣品的上樣濃度在 0.5 - 2 μg/μL，核酸樣品在 50 - 200 ng/μL 較為合適。同時(shí)，上樣體積也不宜過(guò)大，以免超過(guò)樣品槽的容量或使條帶過(guò)度擴(kuò)散，一般不超過(guò)樣品槽體積的 2/3。

電泳過(guò)程控制方面

• 選擇合適的電泳緩沖液：不同的電泳體系需要使用相應(yīng)的緩沖液，以維持穩(wěn)定的 pH 值和離子強(qiáng)度。例如，SDS - PAGE 電泳常用 Tris - 甘氨酸緩沖液，其 pH 值為 8.3 左右，能保證蛋白質(zhì)在電泳過(guò)程中帶有穩(wěn)定的負(fù)電荷。緩沖液的離子強(qiáng)度也會(huì)影響電泳效果，離子強(qiáng)度過(guò)高會(huì)產(chǎn)生大量熱量，導(dǎo)致凝膠變形；過(guò)低則會(huì)使電泳速度減慢，條帶擴(kuò)散。

• 優(yōu)化電泳參數(shù)：包括電壓、電流和電泳時(shí)間等。在電泳開(kāi)始時(shí)，可以采用較低的電壓或電流，使樣品在凝膠中緩慢進(jìn)入并分布均勻，然后再逐漸升高電壓或電流，以提高分離速度。但要注意避免電壓或電流過(guò)高，導(dǎo)致條帶變形或過(guò)熱。電泳時(shí)間要根據(jù)樣品的分子量大小和凝膠的長(zhǎng)度來(lái)確定，一般來(lái)說(shuō)，分子量較小的樣品需要較短的電泳時(shí)間，而分子量較大的樣品則需要較長(zhǎng)的時(shí)間，以保證不同分子量的物質(zhì)能夠充分分離。例如，在分離分子量為 10 - 100 kDa 的蛋白質(zhì)時(shí)，通常在 100 - 150 V 的電壓下電泳 1 - 2 小時(shí)。

染色和檢測(cè)方面

• 選擇合適的染色方法：根據(jù)樣品的類(lèi)型和檢測(cè)目的選擇合適的染色劑。例如，考馬斯亮藍(lán)染色法適用于蛋白質(zhì)的常規(guī)檢測(cè)，靈敏度較高，能檢測(cè)到微克級(jí)的蛋白質(zhì)；銀染法的靈敏度比考馬斯亮藍(lán)染色法更高，可檢測(cè)到納克級(jí)的蛋白質(zhì)，但操作相對(duì)復(fù)雜，且成本較高。對(duì)于核酸的檢測(cè)，常用溴化乙錠（EB）染色，它能嵌入到核酸的雙鏈結(jié)構(gòu)中，在紫外光下發(fā)出熒光，檢測(cè)靈敏度較高，但 EB 具有致癌性，使用時(shí)需注意安全。也可以選擇一些無(wú)毒的核酸染色劑，如 SYBR Green 等。

• 優(yōu)化染色和脫色條件：染色時(shí)間和溫度要適當(dāng)，一般考馬斯亮藍(lán)染色需要將凝膠浸泡在染色液中 1 - 2 小時(shí)，在室溫下進(jìn)行即可。染色后需要進(jìn)行脫色處理，以去除背景顏色，使條帶更加清晰。脫色液通常為含有乙醇和乙酸的水溶液，脫色時(shí)間可能需要數(shù)小時(shí)甚至過(guò)夜，期間要更換幾次脫色液，直到背景顏色較淺，條帶清晰為止。對(duì)于銀染和 EB 染色等，也需要按照相應(yīng)的操作規(guī)程進(jìn)行染色和脫色處理，以獲得最佳的檢測(cè)效果。